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原创文章

原创文章:浅谈生物指示剂的16S rDNA菌种鉴定

2019-07-17 宝录生物

1、生物指示剂中的指示微生物
 
生物指示剂系一类特殊的活微生物制品,可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的芽孢。常见的孢子形成菌包括嗜热脂肪芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌等。
 
芽孢是某些细菌在其生长发育的后期,在细胞内形成的一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体,壁厚、含水量低、抗逆性强。如下图所示,芽孢具有厚的孢外壁、芽孢衣、芽孢皮层、芽孢壁、芽孢膜,而DNA位于这些结构的内部。芽孢没有新陈代谢,能经受多种环境伤害,包括热、紫外线、多种溶剂、酸、碱、酚类、醛、酶和烷基化试剂的处理。

 

 

 

2、生物指示剂质量复核中的菌种鉴定
 
16SrDNA鉴定是基因型微生物鉴定方法之一,是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定,包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤,是一种快速获得细菌种属信息的方法,也是一种可以用于生物指示剂菌种鉴定的方法。
 
由于上文提到的生物指示剂中芽孢的特殊结构特征,常规的DNA提取方法难以破坏芽孢的细胞结构,很难得到高质量的DNA样品。需要将生物指示剂进行预培养,使得芽孢变成营养体,获得单菌落,进行后续的菌种鉴定步骤,一方面是因为营养体DNA更容易得到,另一方面,以下法规也提到了菌种鉴定时,需要先获得纯的培养物,也就是单菌落。

 

中国药典2015版9204《微生物鉴定指导原则》1.待检菌的分离纯化提到:微生物鉴定的第一步是待检培养物的分离纯化,最常用的分离纯化方法是挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线分离纯化,以获取待检菌的纯培养物(单个菌落)。4.基因型微生物鉴定中提到:微生物基因型通常不受生长培养基或分离物活性的影响,只需分离到纯菌落便可用于分析。2020版药典征求意见稿《细菌DNA特征序列鉴定法》(新增)待检菌测定(1)分离纯化挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线培养,以获取纯培养物(单个菌落)。

 

关于生物指示剂菌种鉴定时应该进行哪些前处理,如果是对未经过灭菌的生物指示剂(例如,进行质量复核)进行菌种鉴定,则不能直接对生物指示剂进行培养。

 
(1)对于非液体生物指示剂,如芽孢条、自含式生物指示剂(EZTest),需要将载体如滤纸条放入水中,进行机械破碎或浸泡,使得芽孢从载体上脱落,使用无菌接种环将液体划线至TSA平板上,在适当的温度下培养24至48小时,以获得单菌落,用于生化检测或遗传鉴定。

 

(2)对于液体生物指示剂或芽孢悬浮液,可以打开或压碎安瓿瓶,或打开孢子悬浮液,使用无菌接种环将液体涂布在TSA平板上,并在适当的温度下培养24至48小时,以获得单菌落,用于鉴定。

 

3、生物指示剂报阳后的菌种鉴定

 

如果想要鉴定导致阳性结果的微生物种类,只需将阳性生物指示剂中的含有微生物的培养基涂布在TSA平板上,在适当的温度下培养24至48小时即可获得分离的菌落。特别需要注意的是,必须在看到阳性结果(快速培养基变黄)后立即将培养基划线到TSA板上,等待时间过长的话,营养细胞会代谢培养基中的碳水化合物,产生酸性副产物,长时间暴露于酸性环境将杀死所有营养细胞,导致接种到TSA后无法生长。
 
另外一点值得注意的是安瓿瓶生物指示剂的菌种鉴定,例如DriAmp干热灭菌指示剂在质量复核时菌种鉴定结果正确,报阳后进行菌种鉴定时却发现不是该生物指示剂中应有的菌种,可见在灭菌后到鉴定的过程中带入了污染,导致了假阳性。为了避免操作中带入污染,在打碎DriAmp生物指示剂时,需要先用70% IPA(异丙醇)对安瓿瓶进行消毒。