1、生物指示剂中的指示微生物
 
生物指示剂系一类特殊的活微生物制品,可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的芽孢。常见的孢子形成菌包括嗜热脂肪芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和生孢梭菌等。
 
芽孢是某些细菌在其生长发育的后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体，壁厚、含水量低、抗逆性强。如下图所示，芽孢具有厚的孢外壁、芽孢衣、芽孢皮层、芽孢壁、芽孢膜，而DNA位于这些结构的内部。芽孢没有新陈代谢，能经受多种环境伤害，包括热、紫外线、多种溶剂、酸、碱、酚类、醛、酶和烷基化试剂的处理。

2、生物指示剂质量复核中的菌种鉴定
 
16SrDNA鉴定是基因型微生物鉴定方法之一，是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定，包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤，是一种快速获得细菌种属信息的方法，也是一种可以用于生物指示剂菌种鉴定的方法。
 
由于上文提到的生物指示剂中芽孢的特殊结构特征，常规的DNA提取方法难以破坏芽孢的细胞结构，很难得到高质量的DNA样品。需要将生物指示剂进行预培养，使得芽孢变成营养体，获得单菌落，进行后续的菌种鉴定步骤，一方面是因为营养体DNA更容易得到，另一方面，以下法规也提到了菌种鉴定时，需要先获得纯的培养物，也就是单菌落。

关于生物指示剂菌种鉴定时应该进行哪些前处理，如果是对未经过灭菌的生物指示剂（例如，进行质量复核）进行菌种鉴定，则不能直接对生物指示剂进行培养。

 
（1）对于非液体生物指示剂，如芽孢条、自含式生物指示剂（EZTest），需要将载体如滤纸条放入水中，进行机械破碎或浸泡，使得芽孢从载体上脱落，使用无菌接种环将液体划线至TSA平板上，在适当的温度下培养24至48小时，以获得单菌落，用于生化检测或遗传鉴定。

（2）对于液体生物指示剂或芽孢悬浮液，可以打开或压碎安瓿瓶，或打开孢子悬浮液，使用无菌接种环将液体涂布在TSA平板上，并在适当的温度下培养24至48小时，以获得单菌落，用于鉴定。

3、生物指示剂报阳后的菌种鉴定

如果想要鉴定导致阳性结果的微生物种类，只需将阳性生物指示剂中的含有微生物的培养基涂布在TSA平板上，在适当的温度下培养24至48小时即可获得分离的菌落。特别需要注意的是，必须在看到阳性结果（快速培养基变黄）后立即将培养基划线到TSA板上，等待时间过长的话，营养细胞会代谢培养基中的碳水化合物，产生酸性副产物，长时间暴露于酸性环境将杀死所有营养细胞，导致接种到TSA后无法生长。
 
另外一点值得注意的是安瓿瓶生物指示剂的菌种鉴定，例如DriAmp干热灭菌指示剂在质量复核时菌种鉴定结果正确，报阳后进行菌种鉴定时却发现不是该生物指示剂中应有的菌种，可见在灭菌后到鉴定的过程中带入了污染，导致了假阳性。为了避免操作中带入污染，在打碎DriAmp生物指示剂时，需要先用70% IPA(异丙醇)对安瓿瓶进行消毒。