Growth Promotion Test Guide for Media Used in Tests for Burkholderia cepacia complex

洋葱伯克霍尔德菌复合群检测用培养基促生长测试指南

Tests for Burkholderia cepacia complex / 洋葱伯克霍尔德菌复合群检测

The purpose of the Tests for Burkholderia cepacia complex is to determine if Bcc microorganisms can be detected in a nonsterile, aqueous-based pharmaceutical product or component and whether they exceed pharmacopeial limits. Product categories include preparations for inhalation and aqueous preparations for oral, oromucosal, cutaneous, or nasal use. / 本检测旨在确定非无菌水性药品或其组分中能否检出洋葱伯克霍尔德菌复合群（Bcc）微生物，以及其数量是否超过药典规定限度。适用产品包括吸入制剂，以及口服、口腔黏膜、皮肤或鼻用水性制剂。

Before testing a product, the laboratory must know whether the test medium can grow the specified microorganism when it is present in small numbers. / 在检测产品之前，实验室必须确认所用培养基能够使少量存在的指定微生物生长。

The objective of the Growth Promotion Test is to demonstrate that the medium supports growth and shows the correct indicative reactions of the specified organism. New batches are inoculated with a small number of microorganisms; suitable media support growth and exhibit the expected selective or inhibitory properties. / 培养基促生长的目的是证明培养基能够支持指定微生物生长，并呈现正确的指示性反应。实验室用少量微生物接种新批次培养基；合格培养基应支持其生长，并表现预期的选择性或抑制性。

The Media / 培养基

The media used in these tests are designed to isolate microorganisms in the Bcc. They are listed in Table 2. / 本检测所用培养基用于分离 Bcc 微生物，详见表 2。

The Microorganisms / 微生物

Table 1 lists the reference culture strains used for the Growth Promotion Test, based on the United States Pharmacopeia (USP). At the time of this guide, the Bcc test is official only in the USP. / 表 1 列出了培养基促生长试验所用参考菌株，依据《美国药典》（USP）。截至本指南发布时，Bcc 检测仅在 USP中为法定方法。

The listed Microbiologics products are lyophilized preparations no more than three passages from the reference culture. Product information is available at www.microbiologics.com. / 表中所列 Microbiologics 产品为冻干微生物制剂，距参考菌种不超过 3 代。产品信息见www.microbiologics.com。

• EZ-Accu Shot™: five vials of one enumerated microorganism (one pellet per vial) and five 1.2 ml vials of Hydrating Fluid. Each 0.1 ml inoculum delivers 10-100 CFU when prepared as directed; 50 tests per kit. / EZ-Accu Shot™：5 瓶同一种定量微生物（每瓶 1 粒冻干菌球）和 5 瓶水化液（每瓶 1.2 ml）。按说明制备后，每 0.1 ml 接种液含 10-100 CFU；每盒共可进行 50 次试验。

• Bcc Select™: five vials, each containing a different strain (five strains total), plus five 1.2 ml vials of Hydrating Fluid. Each 0.1 ml inoculum delivers 10-100 CFU; 50 tests per kit. / Bcc Select™：5 瓶、每瓶一种不同菌株（共 5 株），另含 5 瓶水化液（每瓶 1.2 ml）。每 0.1 ml 接种液含10-100 CFU；每盒共可进行 50 次试验。

• Epower™: one vial containing ten pellets of one enumerated microorganism; available in many strains at 10²-10⁸ CFU per pellet. / Epower™：每瓶含同一种定量微生物的 10 粒菌球；可选多种菌株，浓度范围为每粒 10²-10⁸ CFU。

Table 1. Microbiologics Catalog Numbers / 表 1. Microbiologics 目录编号

Requirements of the Test / 试验要求

1.Perform the Growth Promotion Test on each new batch of purchased ready-prepared medium, dehydrated medium, or medium prepared from components in the laboratory. / 每一新批次的成品培养基、脱水培养基或实验室用组分配制的培养基均须进行促生长试验。

2.Inoculate medium with ≤100 CFU for growth-promoting and indicative properties; use ≥100 CFU for inhibitory properties. / 促生长性和指示性试验的接种量应 ≤100 CFU；抑制性试验的接种量应 ≥100 CFU。

3.Use pharmacopeia-recommended strains no more than five passages from the reference culture. / 使用药典推荐菌株，且距参考菌种不超过 5 代。

4.Test new medium in parallel with previously approved medium. Use approved non-selective agar to determine inoculum CFU as the standard value. Use the same inoculum, technician, and incubation conditions; the medium must be the only variable. / 新培养基应与已批准培养基平行试验。用已批准的非选择性琼脂测定接种液 CFU，并以此为标准值。两批培养基须由同一人员使用同一接种液、在相同培养条件下操作，唯一变量应为培养基。

5.Test each medium with only one microorganism strain at a time. / 每次仅用一种微生物菌株测试一种培养基。

6.Test in duplicate. / 进行双份平行试验。

Materials / 材料

• EZ-Accu Shot™, Bcc Select™, or Epower™ kits / EZ-Accu Shot™、Bcc Select™ 或 Epower™ 套装

• New batch and previously approved batch of medium / 新批次培养基和已批准批次培养基

• Non-selective agar when testing liquid medium / 检测液体培养基时所需的非选择性琼脂

• Calibrated micropipette; inoculum spreader; vortex mixer / 经校准的微量移液器、接种液涂布器和涡旋混合器

• Epower™ and sterile pH 7.2 phosphate buffer when testing inhibitory properties / 检测固体和/或液体培养基抑制性时所需的 Epower™ 与无菌 pH 7.2 磷酸盐缓冲液

Test Procedures / 试验步骤

Growth-Promoting and Indicative Properties of Burkholderia Selective Agar / 伯克霍尔德菌选择性琼脂的促生长特性与指示性

1.Prepare an inoculum for each required microorganism according to the EZ-Accu Shot™ Instructions for Use. If using Epower™, hydrate one pellet in 10 ml pH 7.2 phosphate buffer and serially dilute to a final total dilution of 1:10,000. A 0.1 ml inoculum from this dilution yields 10-100 CFU. / 按 EZ-Accu Shot™ 使用说明为每种所需微生物制备接种液。若使用 Epower™，将 1 粒菌球在 10 ml pH 7.2磷酸盐缓冲液中复水，并连续稀释至最终总稀释倍数 1:10,000。取该稀释液 0.1 ml 可得到 10-100 CFU。

2.Inoculate new and previously approved media with 0.1 ml suspension. A non-selective agar control is recommended to verify that 0.1 ml contains ≤100 CFU. / 用 0.1 ml 微生物悬液接种新批次及已批准批次培养基。建议用非选择性琼脂作对照，以确认 0.1 ml悬液中微生物数 ≤100 CFU。

3.Spread the inoculum evenly across the agar. / 用涂布器将接种液均匀涂布于琼脂表面。

4.Incubate at the pharmacopeial temperature and duration for each microorganism (Table 2). / 按药典规定的温度和时间培养各微生物（见表 2）。

5.Assess suitability using the acceptance criteria below. / 按下述接受标准判断新培养基是否适用。

Acceptance Criteria / 接受标准

Solid medium. Average colony counts for the new and approved batches. For each microorganism, the new-batch mean must be“comparable” to the approved-batch mean. USP does not establish a quantitative definition of “comparable.” The non-selective agar control must have ≤100 colonies. /固体培养基。分别计算新批次与已批准批次培养基的平均菌落数。对每种受试微生物，新批次的平均菌落数必须与已批准批次“可比”。USP 未对“可比”作定量定义。非选择性琼脂对照上的菌落数必须 ≤100。

Indicative reactions. Visually compare colonies with those on the previously approved batch. Appearance should be similar; expected reactions are shown in Table 2. / 指示性反应。目视比较新批次与已批准批次培养基上的菌落。菌落外观应相似；预期指示性反应见表 2。

Table 2. Growth Promotion Test Requirements for Bcc / 表 2. Bcc 促生长试验要求

Inhibitory Properties of Solid Media / 固体培养基的抑制性

1.Prepare each required microorganism using Epower™ E3 or E7. / 使用 Epower™ E3 或 E7 制备每种所需微生物的接种液。

2.Rehydrate one E3 pellet in 1.0 ml or one E7 pellet in 10 ml hydration fluid. E3 contains 1,000-9,999 CFU, yielding 100-999 CFU/0.1 ml. E7 contains 10,000,000-99,999,999 CFU per pellet; after rehydration it yields 1,000,000-9,999,999 CFU/ml and must be diluted further to 100-999 CFU/0.1 ml. / 按说明将 1 粒 E3 菌球在 1.0 ml 水化液中复水，或将 1 粒 E7 菌球在 10 ml 水化液中复水。E3 每粒含 1,000-9,999 CFU，可得到 100-999 CFU/0.1 ml；E7 每粒含 10,000,000-99,999,999 CFU，复水后为 1,000,000-9,999,999 CFU/ml，须进一步稀释至最终 100-999 CFU/0.1 ml。

3.Inoculate new and approved media with 0.1 ml suspension. / 用 0.1 ml 微生物悬液接种新批次及已批准批次培养基。

4.Use a non-selective agar control to verify ≥100 CFU in 0.1 ml. / 建议用非选择性琼脂对照确认 0.1 ml 悬液中含 ≥100 CFU。

5.Spread evenly. / 均匀涂布接种液。

6.Incubate according to Table 2. / 按表 2 规定培养。

7.Assess suitability using the criteria below. / 按下述接受标准判断适用性。

Acceptance criteria: the test microorganism must be inhibited on the new agar batch, and the non-selective control agar must have≥100 colonies. / 接受标准：受试微生物应在新批次琼脂上受到抑制；非选择性对照琼脂上的菌落数应 ≥100。

Best Practices for Growth Promotion Tests / 促生长测试最佳实践

Preparation / 准备

Use pharmacopeia-recommended strains traceable to, and no more than five passages from, the reference culture. / 使用药典推荐菌株；菌株应可追溯至参考菌种，且传代次数不超过 5 代。

Equipment / 设备

• Use an automatic calibrated micropipette and routinely verify its accuracy. / 使用经校准的自动微量移液器，并定期核查准确度。

• Calibrate thermometers and incubators annually. / 温度计和培养箱每年校准。

Control / 对照

A negative control (diluent) is recommended. The diluent is Hydrating Fluid; for Epower™, it is pH 7.2 phosphate buffer. Microbiologics performs sterility testing on kit Hydrating Fluid, and a Certificate of Analysis is available on request. Additional fluid is catalog no. HF0611. / 建议设置阴性对照（稀释液）。稀释液为水化液；使用 Epower™ 时为 pH 7.2 磷酸盐缓冲液。Microbiologics已对试剂盒中的水化液进行无菌试验，并可按要求提供分析证书。另售水化液目录编号为 HF0611。

The Test / 试验操作

• Allow the medium and pellet vial to equilibrate to room temperature. / 使用前将培养基和菌球瓶平衡至室温。

• For Epower™, warm hydration and dilution fluids for 30 minutes at 35°C. / 使用 Epower™ 时，水化液和所有稀释液应在 35°C 预温 30 分钟。

• For the pour-plate method, add 0.1 ml suspension to a sterile Petri dish, pour molten agar over it, mix by swirling, allow to solidify, then invert and incubate. / 采用倾注平板法时，将 0.1 ml 微生物悬液加入无菌培养皿，倒入熔融琼脂并旋转混匀；凝固后倒置培养。

• Cool molten medium to 44-46°C before pouring. Do not keep it molten longer than four hours, and do not re-solidify and reuse unused medium. / 熔融培养基倒注前须冷却至 44-46°C；熔融状态不得超过 4 小时，未用培养基不得再次凝固后重复使用。

• Selective agar may require doubling the inoculum. If so, inoculate selective and non-selective agar in parallel; the non-selective agar must show ≤100 colonies. / 选择性琼脂可能需要将接种量加倍。此时应平行接种选择性和非选择性琼脂；非选择性琼脂上的菌落数必须≤100。

Incubation / 培养

Because pour plates require longer incubation and colony size varies, a backlit colony counter is recommended. / 由于倾注平板需要更长培养时间且菌落大小存在差异，建议使用背光式菌落计数器。

Other Considerations / 其他注意事项

• Recovery on BCSA may be lower than on non-selective media. / BCSA 上的回收率可能低于非选择性培养基。

• Microbiologics validated procedures for EZ-Accu Shot™, Bcc Select™, and Epower™ on TSA for B. cepacia ATCC® 25416™, B. cenocepacia BAA-245™, B. multivorans BAA-247™, P. paraeruginosa 9027™, and S. aureus 6538™. / Microbiologics 已验证 EZ-Accu Shot™、Bcc Select™ 和 Epower™ 在 TSA 上用于以下菌株的操作程序：B. cepacia ATCC® 25416™、B. cenocepacia BAA-245™、B. multivorans BAA-247™、P. paraeruginosa 9027™ 和 S. aureus 6538™。

• A customer qualification study is recommended to verify performance with the selected BCSA manufacturer, company procedures, and equipment. / 建议客户开展确认研究，以验证产品适用于所选 BCSA 厂家、企业程序和设备。

• Product safety may require testing organisms beyond those named in the USP Bcc test. See the Microbiologics website for other growth-promotion microorganisms. / 为确保最终用户安全，药品可能还需检测 USP Bcc 试验未列出的其他微生物。可访问 Microbiologics网站查看其他适用于生长促进试验的微生物。

• Wild-type environmental isolates may contaminate pharmaceutical products. Include relevant isolates in growth-promotion testing to ensure they grow on new media batches. Microbiologics can characterize, preserve, and manufacture customer isolates in ready-to-use formats. / 生产环境中的野生型微生物菌株可能污染药品。进行生长促进试验时应纳入相关环境分离株，以确保其能够在新批次培养基上生长。Microbiologics 可对客户环境分离株进行鉴定、保藏，并制成即用型质控品。

Reference / 参考文献

United States Pharmacopeia <60>, Microbial Examination of Nonsterile Products: Test for Burkholderia cepacia Complex. United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD. / 《美国药典》通则<60>《非无菌产品的微生物检查：洋葱伯克霍尔德菌复合群检查》，美国药典委员会，马里兰州罗克维尔。

Illustrated Instructions: Growth-Promoting and Indicative Qualities / 图示说明：生长促进性和指示性

Testing new batches of solid medium used in tests for specified microorganisms. / 用于指定微生物检查的新批次固体培养基测试。

1.Prepare an inoculum for each required microorganism according to the EZ-Accu Shot™ Instructions for Use. / 按 EZ-Accu Shot™ 使用说明为每种所需微生物制备接种液。

2.Inoculate the new and previously approved media with 0.1 ml microorganism suspension. / 用 0.1 ml 微生物悬液接种新批次和已批准批次培养基。

3.Use a non-selective agar control to verify that 0.1 ml contains ≤100 CFU. / 使用非选择性琼脂对照，确认 0.1 ml 接种液中含 ≤100 CFU。

4.Spread the inoculum evenly across the agar. / 将接种液均匀涂布于琼脂表面。

5.Follow pharmacopeial incubation temperature and duration for each microorganism (Table 2). / 按药典规定的温度和时间培养各受试微生物（见表 2）。

6.Determine suitability using the acceptance criteria. / 按接受标准判断新培养基是否适用。

Illustrated Instructions: Inhibitory Qualities / 图示说明：抑制性

Testing inhibitory qualities of new solid-medium batches using Epower™ E3 and E7. Although illustrated with solid medium, the process can also be applied to liquid medium. / 使用 Epower™ E3 和 E7 测试新批次固体培养基的抑制性。图中虽为固体培养基，该流程也可用于液体培养基。

1.Rehydrate one E3 pellet in 1.0 ml or one E7 pellet in 10 ml pH 7.2 phosphate buffer; dilute to 100-999 CFU/0.1 ml. / 将 1 粒 E3 菌球在 1.0 ml、或 1 粒 E7 菌球在 10 ml pH 7.2 磷酸盐缓冲液中复水；稀释至 100-999 CFU/0.1 ml。

2.Inoculate new and previously approved media with 0.1 ml suspension. / 用 0.1 ml 悬液接种新批次和已批准批次培养基。

3.Use a non-selective agar control to verify ≥100 CFU in 0.1 ml. / 用非选择性琼脂对照确认 0.1 ml 中含 ≥100 CFU。

4.Spread the inoculum evenly across the agar. / 将接种液均匀涂布于琼脂表面。

5.Follow pharmacopeial incubation directions (Table 2). / 按药典规定进行培养（见表 2）。

6.Determine suitability using the acceptance criteria. / 按接受标准判断新培养基是否适用。

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