使用多个平行BI评估汽化过氧化氢灭菌程序

2024-09-26

导读

在灭菌过程中，经过预真空排气的加压饱和蒸汽是具有穿透能力的，但对于常压下的蒸汽来说，其穿透能力就会削弱很多。由于VH2O2的穿透能力有限，因此芽孢在载体表面的附着情况会影响BI是否能正确发挥作用。此外，如果在芽孢之间存在着任何杂质，将会导致原本应该被VH2O2杀死的芽孢存活。这种BI经常被称为“流氓BI”。

如果在灭菌程序的确认期间意外地出现了阳性BI，无法确定到底是由于芽孢在不锈钢片上附着的缺陷导致的问题还是由于预期灭菌程序致死率的偏差造成的。当每一个测试点位仅使用一个BI时，如果出现了阳性结果，通常需要对灭菌程序进行重新验证，这将大幅度提高客户的成本，这种情况是令人难以接受的。PDA第51号技术报告第8.1节建议，可以使用不同批次的BI或者在同一位置放置2个或3个BI对灭菌程序进行重新验证。

本文将讨论同时使用3个BI的验证方法，该方法是一种针对在VH2O2灭菌过程中可能产生的问题的预防措施，而不是作为意外得到阳性BI后的补救方法。MesaLabs研究案例表明，即使是最高品质的不锈钢载体BI，其坏品率也会达到0.3%左右。因此，如果我们不可避免地会遇到流氓BI，那么为什么不提前做好准备来应对这种情况呢？

在每个测试位点使用多个BI的原因是：我们需要让每个位点都有平行试验的数据。可能会有读者质疑这一点——因为MesaLabs作为BI的制造商，推荐的检测方法使得BI的消耗增加了三倍。但是具体的情况并非大家想象的那样。我们的验证技术人员在隔离器中选择了30/40个最难以灭菌的位点，在每个位置放置了3个BI，使得每次测试灭菌程序消耗90/120个BI。但是，这相比起在这个隔离器中分散地布置100个检测位点要更加有效。当有了平行试验，如果我们在同一位点的3个平行BI中观察到了1个（或2个）阳性BI出现的情况，我们就可以使用Halvorson-Zegler方程来计算存活芽孢最可能的数量（MPN）。如果每个测试位点只使用1个BI，并且最终得到了阳性的结果，那么就无法计算该结果是由一个存活的芽孢还是成千上万个存活的芽孢引起的。

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Halvorson-Zegler方程为：MPN = ln (n/r)

其中:

MPN = 存活芽孢的最大可能数

ln = 自然对数函数

n = 每个离散位置测试的平行BI数量

r = 每个离散的位置测试的生长阴性BI数量

让我们来看一个例子，如果在VH2O2灭菌程序中，我们观察到在某一检测位点上放置的3个BI中，结果是1个阳性BI和2个阴性BI（即，n=3和r=2），我们该如何计算？

MPN = ln (3/2) = 0.405

MPN的结果表明，平均每个BI有0.405个存活的芽孢。3个BI中有2个是生长阴性的，因此我们知道这2个BI中都没有存活芽孢。现在我们已经计算出了MPN值，下一步是使用这个数值来计算与2个阴性BI和1个阳性BI相关的芽孢对数减少量（SLR）。为此，我们有以下方程式：

SLR = Log10 N0 – Log10 MPN

其中:

SLR = 芽孢对数减少值

N0 = 未暴露BI上的初始芽孢数量

如果所用BI批次的COA上每个BI的初始芽孢数量为1.6 x 106个芽孢，则SLR计算为:

SLR = Log10 1.6 x 106 – Log10 0.405

SLR = 6.204 – (-0.393)

SLR = 6.597

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因此，可以看出，即使在同一个检测位点放置了3个BI且有1个生长阳性BI，但仍然可以证明在那个特定测试位点，芽孢数量下降超过了6个对数单位。需要注意的是，这种计算方式只有使用多个平行BI的时候才能使用。如果将100个BI分散放置于100个离散的测试位点上，就不适合使用上述的MPN和SLR计算，因为这100个单独的BI不是其他BI的平行。

那么出现阳性BI的结果是由于芽孢在不锈钢片上附着的缺陷还是由于预期灭菌程序致死率的偏差造成的？对于这个问题，我认为导致阳性结果的原因并不重要。毕竟，我们在那个检测位点观察到了阴性的结果，通过数学分析也得出了芽孢数量下降超过6个对数单位的结论。当然，如果3个BI都得到了阳性的结果，或者如果在多次测试中经常在不同的位置观察到有阳性BI的产生，那么我们必须引起重视——灭菌程序中可能存在缺陷。相反，如果使用了放置3个BI平行的方法，并在大多数的验证中没有发现阳性BI的存在，当在某一次的验证中意外地观察到阳性BI的结果的时候，此时应该判断这次灭菌程序验证通过，不必去理会产生阳性BI的真正原因是什么。

采用多个平行BI的验证方法作为您的日常标准验证方法，是为不可避免的情况做的准备。如果确实出现了BI阳性的情况，而我们已经准备好了统计分析方法来评估这一情况，那么就可以避免重新进行灭菌程序的验证。

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