摘要

定量工作菌株，是实验室按照统一标准制备、活菌浓度已知、纯度合格，可直接用于实验接种的工作菌悬液；也包含商品化冻干定量菌株，复溶后作为起始菌种再制备成标准化工作菌液，广泛应用于培养基水平促生长实验，如溶磷、解钾、产 IAA、产铁载体、固氮等体外功能测定。在促生测试中，接种浓度不一致是平行样偏差、数据不可重复的主要诱因，而定量工作菌株的核心价值，就是实现接种活菌量可控、批次间稳定，减少人为稀释误差，保障透明圈、显色定量、生长测定结果真实可比。本文从定量工作菌株定义、制备流程、商品化定量菌株转化为工作菌株操作、质控标准、使用规范、常见风险等方面展开说明，为培养基促生长功能评价提供标准化方案。

一、定量工作菌株基本概念与应用场景

定量工作菌株区别于原始保藏菌株、普通斜面菌种，它是为单次或同批次试验定制、活菌浓度明确、经过纯度与活菌计数验证的工作菌液，分为两种来源：一是实验室自行扩培制备；二是商品化定量冻干菌株复溶后，经过纯化、扩培、标定浓度得到的标准化菌液。

它最典型的应用就是培养基促生长体外实验：平板定性筛选（溶磷透明圈、CAS 铁载体平板）、液体培养基定量测试（IAA、溶磷定量、生长曲线测定），也可用于培养基适用性检查、阳性对照试验、方法验证。 普通菌种只知道菌株种类，不知道准确活菌数；定量工作菌株在使用前完成活菌标定，实验组、对照组、重复组可以精准统一接种量，从源头降低实验误差。常用菌株包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、假单胞菌、伯克氏菌、根瘤菌等植物促生菌。

二、定量工作菌株前期准备

1.菌种选择 可选用权威保藏中心标准菌株，或商品化定量冻干菌株。商品化定量菌株出厂已鉴定、初定量，适合快速启动促生筛选，但出厂数值仅为出厂参考值，不能直接当作定量工作菌株使用，仍需要在本实验室重新纯化、扩培、活菌标定。

2.培养基区分 分为菌株活化培养基和促生测试培养基，不可混用。活化用 LB、NA、PDA 等；促生测试采用蒙金娜无机磷培养基、无氮固氮培养基、Salkowski 检测培养液、CAS 检测平板等。培养基 121℃灭菌 20 min，设置空白对照。

3.耗材仪器准备 无菌离心管、枪头、培养皿、移液枪、恒温摇床、分光光度计、超净台等；仪器提前校准，OD₆₀₀、稀释涂布计数是定量标定的关键手段。

三、定量工作菌株制备流程

3.1 菌株复苏纯化

如果起始材料是商品化定量冻干菌株：在超净台按说明书加入无菌复溶液，充分涡旋溶解，划线接种活化平板，连续纯化 2～3 代，挑选形态一致的单菌落。即便商品化菌株出厂纯化，运输、复溶过程依然存在污染风险，纯化步骤不可省略。 如果是 – 80℃甘油保藏菌株，取出快速融化后划线纯化，挑取典型单菌落。纯化后可通过菌落形态、革兰染色初步核验，长期试验建议 16S rRNA/ITS 测序复核。

3.2 种子液扩培

挑取合格单菌落接入液体活化培养基制备种子液。细菌 160～200 r/min、28～30℃振荡培养；真菌低速振荡或静置培养。定时监测 OD₆₀₀，选取对数生长期菌液用于制备定量工作菌株。对数期菌株代谢活性稳定，分泌促生相关代谢物的能力稳定，更适合培养基促生测试。

3.3 梯度稀释与活菌标定（核心步骤）

将对数期种子菌液用无菌生理盐水或者无菌培养基梯度稀释，采用涂布平板法进行活菌计数，计算原液 CFU/mL。 根据实验方案目标接种浓度（如 1×10⁷ CFU/mL）进行稀释调配，混匀后，即得到定量工作菌株。

关键要点：只依靠 OD 值换算存在偏差，正式促生测试必须结合平板计数校准；同一批实验所有定量工作菌株统一稀释方式、统一溶剂。

3.4 分装标记

定量完成后按需分装无菌离心管，标注菌株名称、编号、标定活菌浓度、制备日期、有效期、操作人员。定量工作菌株建议现配现用，不长期存放。

四、定量工作菌株质控要求

只有通过全部质控，才可接入促生测试培养基：

1.纯度检查：取少量工作菌液涂布活化平板，确认只有目标菌株，无杂菌、霉菌污染。杂菌会在测试培养基中生长，造成假阳性透明圈、异常显色。

2.活菌浓度复核：稀释配制完成后，可再做一次计数复核，确认浓度和目标值偏差在可接受范围。

3.功能预验证：对于促生功能测试，正式批量实验前，可在目标测试培养基上做预实验，确认菌株促生功能正常，没有因为传代衰退导致溶磷、产 IAA 能力下降。

4.传代管控：从原始菌种到制备定量工作菌株，总传代次数控制在 5 代以内；商品化定量菌株不反复复溶、多次传代使用。

五、商品化定量菌株直接复溶 vs 实验室自制定量工作菌株

很多实验室容易混淆二者：商品化定量冻干菌株是标准起始材料，不等于可直接上机测试的定量工作菌株。

»»商品化定量冻干菌株：出厂标定活菌数，开箱复溶即可接种，适合快速阳性对照、粗略初筛；缺点是复溶后菌液活性衰减快、批次差异存在、隐性杂菌风险无法排除，不适合精准、可发表的促生长定量实验。

»»实验室自制定量工作菌株：经过纯化、对数期扩培、本实验室活菌标定，浓度精准、活性一致，是培养基促生长正式试验的优选方案；商品化冻干菌株优先作为它的起始菌种。

六、使用管理与注意事项

1.现配现用原则：定量工作菌株配制后尽快使用，细菌工作菌液建议 24 h 内用完，放置过久活菌衰减、代谢状态改变，促生能力发生变化。

2.一次性使用：定量工作菌液不反复冻融，剩余菌液不保留到下一批次实验，避免活菌浓度漂移、污染。

3.平行样同步制备：同一组促生测试，所有实验组的定量工作菌株，尽量同一批次活化、同一时间标定，消除时间差带来的活性差异。

4.储存规范：原始商品化定量菌株按照说明书冷藏或冷冻保存，严格遵守有效期；自制定量工作菌株不长期冷藏保存。

5.台账溯源：记录菌种来源、纯化时间、扩培参数、计数结果、稀释记录、使用项目，实验结果可追溯。

七、常见问题及防控

1.标定浓度偏差大：稀释操作失误、稀释液混匀不充分、培养温度不适、菌株不在对数期；操作时梯度稀释充分涡旋，固定在对数期终点制备。

2.定量工作菌株污染：超净台消毒不到位、耗材灭菌失效、商品化菌株包装破损；每次纯化、质控都做平板纯度验证。

3.促生实验重复性差：不同批次定量工作菌株活菌浓度不一致、菌株传代过多；固定制备流程，优先使用新开启商品化菌株作为菌种源头。

4.活菌快速下降：稀释溶剂不合适、配制后放置太久；优先用无菌培养基作为稀释液，现配现用。

结语

在培养基水平的促生长实验中，定量工作菌株是控制接种变量、保证数据可靠的核心试验材料。无论是从标准保藏菌株，还是商品化定量冻干菌株出发，都需要经过纯化、对数期扩培、活菌标定、纯度质控等步骤，才能得到合格的定量工作菌株。商品化定量菌株能够简化菌种溯源和前期鉴定工作，但不能替代实验室的活菌标定与纯度检查。规范制备、正确使用定量工作菌株，能够有效降低接种量带来的系统误差，提升溶磷、产 IAA、铁载体等促生功能测定的稳定性、平行性，为菌株筛选、功能评价、菌剂研发提供可信的实验支撑。